離子對試劑是一類常用的實(shí)驗(yàn)室試劑，將這類試劑加入到反相色譜流動(dòng)相中可以增強(qiáng)離子樣品的保留。使用離子對試劑可以改善疏水鍵合相表面的離子交換能力，可以在溫和的流動(dòng)相pH條件下更好地控制酸性或堿性樣品的保留。

離子對試劑通過試劑上的疏水部分（常見的有庚烷基，十二烷基）與色譜柱固定相發(fā)生作用而吸附在柱床上，使固定相具有了一定的離子交換能力，從而增強(qiáng)對帶相反電荷的分析物的保留。

例如常見的辛烷磺酸鈉

離子對試劑是添加在流動(dòng)相中的，但是其起作用的地方卻是在色譜柱的固定相中。這里以辛烷磺酸鈉為例子。添加在流動(dòng)相中的離子對試劑隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱，然后離子對試劑會(huì)在色譜柱的固定相和流動(dòng)相之間達(dá)到平衡。

根據(jù)同性相吸的原理，辛烷磺酸鈉中的8個(gè)碳原子的碳鏈會(huì)被弱J性的色譜柱的固定相吸附，而大J性的磺酸根離子卻裸露在色譜柱的固定相外面的流動(dòng)相中。吸附了辛烷磺酸根離子的色譜柱固定相帶上了負(fù)電荷，從而能吸附和保留帶正電荷的化合物。

除了提高色譜柱對目標(biāo)化合物的保留能力，離子對試劑還有一個(gè)作用的是改善峰型。

反相色譜柱的固定相的基質(zhì)主要是硅膠，硅膠表面有大量的羥基。在色譜柱制備過程中嫁接的固定相以及后期的封端工藝會(huì)消耗部分羥基，但是仍然有大量的羥基殘留在硅膠基質(zhì)表面。硅膠基質(zhì)表面的硅羥基和化合物相互作用會(huì)造成拖尾峰。

前面講到離子對試劑對會(huì)填充到固定相的縫隙中，這部分離子對試劑能很好的屏蔽硅膠表面殘留的羥基。從而阻止了目標(biāo)化合物和硅膠表面的羥基相互作用，改善了拖尾峰。

常用的離子對試劑

作用于酸性化合物：
四丁基氫氧化銨， 四丁基氯化銨（四丁基溴化銨），十二烷基*基氯化銨。

作用于堿性化合物：
辛烷磺酸鈉等各種烷基磺酸鹽
三F乙酸，五氟丙酸，七氟丁酸等全氟取代的直鏈有機(jī)酸。（全氟取代的直鏈有機(jī)酸比較特殊，既是離子對試劑也是調(diào)節(jié)pH的強(qiáng)酸）。

但是離子對試劑的使用也會(huì)不可避免引起一些問題，這里就給各位老師做個(gè)介紹。

可能出現(xiàn)的問題和解決方法

色譜柱平衡時(shí)間長

相對于不添加離子對試劑的反相色譜方法，離子對色譜法由于涉及到多種復(fù)雜的平衡過程，因此一般來說使用離子對試劑的色譜柱平衡時(shí)間相對較長。由于離子對試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度，它們要吸附在反相色譜柱填料的表面，表面濃度在0.5-2μmol/m2。1根4.6×250mm的色譜柱大約有3g填料，需要2mmol的離子對試劑才能*的柱平衡。流動(dòng)相濃度為2mmol時(shí)，需要一升流動(dòng)相進(jìn)行平衡。這當(dāng)然是J端條件，但是用幾百毫升的流動(dòng)相去平衡色譜柱也是正常的。

由于平衡時(shí)間長，當(dāng)使用離子對試劑時(shí)選擇梯度洗脫方法可能會(huì)導(dǎo)致一系列的問題，比如保留值重現(xiàn)性較差、基線不穩(wěn)及其它一些分離問題，因此通常不推薦離子對方法中使用梯度方法。但對于使用小分子離子對試劑如三F乙酸（TFA）和三乙胺（TEA）時(shí)，其柱平衡較快，使用梯度洗脫一般也沒問題。

如果需要對色譜柱進(jìn)行清洗，建議使用50%甲醇-水溶液沖洗維護(hù)。

峰形問題
 

通常加入離子對試劑會(huì)改善硅膠基質(zhì)色譜柱上殘留硅醇基團(tuán)帶來的峰形問題。如果在離子對方法中出現(xiàn)峰形問題，如峰前延等，通過改變溫度可以解決。因此當(dāng)遇到峰形不好或者理論塔板數(shù)下降時(shí)，可以研究一下溫度變化對峰形的影響。

空白溶劑峰

在離子對方法中，當(dāng)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)（即注入樣品溶劑）時(shí)，正峰和倒峰有時(shí)候都會(huì)出現(xiàn)，這些異常峰也被稱為空白溶劑峰。這些空白溶劑峰會(huì)干擾液相方法的建立或日常應(yīng)用，因此在離子對方法建立之前和得到有希望的分離之后都應(yīng)該進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

空白溶劑峰問題通常是由流動(dòng)相和樣品溶劑之間的差異造成的，使用的緩沖鹽純度不夠、加入了離子對試劑或者其他流動(dòng)相添加劑都會(huì)放大這種影響。

離子對方法開發(fā)中的變量影響

離子對方法相比于普通反相方法，可以通過調(diào)節(jié)參數(shù)（包括pH、離子對試劑的類型和濃度、溫度）來滿足分離度等要求。

1. 流動(dòng)相的pH：在離子對方法中pH不僅影響分析物的離子化程度，也影響加入的離子對試劑的離子化進(jìn)度而影響與分析物的離子對作用，因此pH的改變對分析物保留的影響更加復(fù)雜。

2. 溫度：離子對方法中溫度的改變會(huì)引起相對保留值發(fā)生顯著性的變化。溫度會(huì)改變色譜柱上吸附的離子對試劑的量，因此控制溫度對分離特別重要。

3. 離子對試劑的類型和濃度：大多數(shù)情況下，固定相中離子對試劑的濃度會(huì)影響溶質(zhì)的離子交換的保留行為，而離子對試劑的類型和濃度會(huì)直接影響其在固定相中的濃度。

當(dāng)想要獲得一定的保留時(shí)，可以使用更低濃度的，疏水性更強(qiáng)的離子對試劑或者更高濃度的，疏水性更弱的離子對試劑。

當(dāng)固定相中的離子對試劑達(dá)到飽和時(shí)，繼續(xù)增加離子對試劑的濃度反而會(huì)降低分析物的保留，因?yàn)殡x子對試劑的反離子濃度增加，加大與分析物的離子交換競爭。

流動(dòng)相的pH和離子對試劑的濃度的同時(shí)改變，則可以在很大程度上控制離子樣品的保留范圍和相對保留值。